Tkotak telur yang keras dan pelindung dari beberapa serangga, seperti kecoa Blatella germanica, membuat tidak mungkin melakukan pengeditan gen CRISPR konvensional, karena komponen harus disuntikkan ke dalam embrio. Namun, tim peneliti internasional telah mengembangkan metode untuk mengedit gen serangga dengan menyuntikkan ribonukleoprotein Cas9 dan memandu RNA langsung ke hemolimf—cairan yang bersirkulasi mirip darah—dari ibu, bukan embrio. Dengan teknik ini, bernama CRISPR “orang tua langsung” (atau DIPA-CRISPR), para peneliti, untuk pertama kalinya, dapat mengedit gen pada kecoak, seperti yang dilaporkan dalam sebuah penelitian yang pertama kali dipublikasikan secara online pada 16 Mei tahun lalu. Metode Laporan Sel.
Injeksi komponen CRISPR ke dalam serangga dewasa untuk mengedit keturunannya telah dicapai sebelum di nyamuk aedes aegypti nyamuk, tetapi metode yang dikembangkan sebelumnya, yang disebut Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo (ReMOT), menggabungkan protein Cas9 ke ligan spesifik spesies, yang meningkatkan efisiensi pengeditan dengan meningkatkan penyerapan Cas9 dan RNA panduan tunggal ke dalam telur yang sedang berkembang. DIPA-CRISPR menghilangkan ligan spesifik spesies, membuat prosedur lebih mudah digeneralisasikan ke spesies lain, kata para peneliti Para ilmuwan.
Hasil yang menggembirakan ini membuka kemungkinan untuk menggunakan teknologi ini pada banyak spesies serangga lain yang sulit disuntikkan pada tahap embrio.
—Omar Akbari, Universitas California, San Diego
“Apa yang mereka tunjukkan di sini adalah, dalam sistem ini, Anda tidak benar-benar membutuhkan ligan penargetan. Mereka hanya menyuntikkan banyak [Cas9] ke dalam hemolimfa selama proses perkembangan telur. Ketika ovarium mengambil banyak bahan dari sistem peredaran darah serangga, kompleks ribonukleoprotein Cas9 tampaknya diambil secara pasif,” kata Jason Rasgon, ahli epidemiologi penyakit di The Pennsylvania State University yang mengembangkan ReMOT tetapi tidak terlibat dalam penelitian ini. belajar.
Rasgon juga menunjukkan penelitian sebelumnya yang menunjukkan pengeditan gen yang berhasil pada tungau laba-laba (Tetranychus urticae) melalui suntikan dewasa. Namun, dia menambahkan bahwa penelitian saat ini adalah “pertama kalinya, setahu saya, terbukti efisien.” Pada tungau laba-laba, peneliti hanya mencapai efisiensi sekitar setengah persen dengan CRISPR-Cas9, yang berarti bahwa pengeditan gen yang diinginkan berhasil diintegrasikan ke situs target satu dari setiap 200 kali. Teknik baru ini mencapai efisiensi hingga 21,8 persen pada kecoak dan lebih dari 70 persen pada kumbang tepung merah Tribolium castaneum.
Lihat “CRISPR Dapat Membuat Duplikasi yang Tidak Diinginkan Selama Knock-in”
Serendipity berperan dalam mengembangkan DIPA-CRISPR, kata Xavier Belles, ahli metamorfosis serangga di Institute of Evolutionary Biology di Barcelona, yang merupakan rekan penulis studi baru. Ketika para peneliti melakukan tes sistematis dari berbagai fragmen peptida untuk dijadikan sebagai ligan penargetan kecoa, mereka memasukkan kelompok kontrol negatif yang tidak menerima ligan sama sekali. Tanpa diduga, “yang kontrol lebih aktif daripada yang lain,” kata Belles Para ilmuwan. “Jadi kami memutuskan untuk bekerja hanya dengan Cas9 dan panduan RNA, dan ini bekerja dengan sangat baik.”
Dengan DIPA-CRISPR, para peneliti menyuntikkan enzim Cas9 yang tersedia secara komersial dan memandu RNA ke dalam hemocoel—rongga tubuh utama—induk kecoa. Injeksi ini harus diatur waktu yang tepat sehingga bertepatan dengan produksi telur, ketika sejumlah besar protein kuning telur dimasukkan ke dalam telur, para peneliti menemukan. “[T]Komponen CRISPR yang kita suntikkan ke dalam tubuh adalah menyertai protein dan masuk juga ke dalam oosit, kemudian mempengaruhi embrio yang akan berkembang nantinya setelah sanggama dan pembuahan,” kata Belles.
Para peneliti juga melakukan percobaan knock-in dengan menambahkan fragmen kecil DNA ke genom kecoa. “Sepengetahuan saya, ini pertama kalinya ditunjukkan dengan prosedur injeksi orang dewasa,” kata Rasgon. Sementara hanya bagian pendek DNA yang ditambahkan, penyisipan cukup panjang untuk menyisipkan sekuens fungsional kecil.
“Hasil menarik ini membuka kemungkinan untuk menggunakan teknologi ini pada banyak spesies serangga lain yang sulit disuntikkan pada tahap embrio,” Omar Akbari, ahli biologi sel dan perkembangan di University of California, San Diego, yang tidak terlibat dalam penelitian ini. penelitian, menceritakan Para ilmuwan dalam sebuah email.
Lihat “Menggunakan Gene Drives untuk Membatasi Penyebaran Malaria”
Takaaki Daimon, ahli genetika di Universitas Kyoto di Jepang yang ikut menulis studi baru, mengatakan Para ilmuwan dalam email bahwa para peneliti ingin mengembangkan metode pengeditan genom “yang dapat digunakan siapa saja dan itu sangat mudah dan murah.” Memang, seperti yang ditunjukkan Rasgon, para peneliti yang ingin mengedit genom dengan DIPA-CRISPR dapat menggunakan Cas9 yang tersedia secara komersial dan tidak lagi harus mengatur sistem ekspresi protein untuk menghasilkan ligan spesifik spesies, seperti ReMOT. Injeksi dewasa juga bekerja tanpa mikroinjektor yang seharusnya diperlukan untuk memasukkan komponen CRISPR ke dalam telur kecil dari berbagai spesies. Rasgon mengatakan bahwa dia akan memberi tahu para peneliti yang ingin mengadaptasi metode ReMOT ke spesies mereka “untuk mencobanya dengan cara ini. [with DIPA-CRISPR] pertama, dan jika itu berhasil, itu bagus. Dan jika tidak, datanglah untuk berbicara dengan kami.” Dia menambahkan bahwa DIPA-CRISPR tidak akan bekerja untuk setiap spesies, karena dia telah mencoba injeksi langsung tanpa ligan pada kutu dan lalat putih tanpa hasil.
Daimon mengharapkan bahwa injeksi dewasa langsung “dapat dilakukan pada sebagian besar serangga”, tetapi mencantumkan beberapa batasan. “Suntikan harus diberikan kepada betina dewasa pada waktu tertentu,” ketika kuning telur terbentuk, dan “periode ini harus diidentifikasi terlebih dahulu untuk setiap spesies target,” tambahnya. “Beberapa spesies tidak memiliki tahap ini; DIPA-CRISPR tidak berlaku untuk mereka.” Akibatnya, DIPA-CRISPR tidak cocok untuk model Drosophila melanogaster atau Diptera yang lebih tinggi, seperti lalat yang stabil Kalsitrans stomoksi, penulis menulis di kertas. Namun demikian, Belles berharap untuk menggunakan metode baru pada kecoa non-model, di mana interferensi RNA, metode yang menggunakan RNA untai ganda urutan-spesifik untuk membungkam ekspresi gen tetapi tidak mengedit genom, sejauh ini telah menjadi satu-satunya cara untuk mengurangi dan menyelidiki fungsi gen, mengatakan Ilmuwan itu “Ini membuka kemungkinan mempelajari fungsi gen yang masih belum kita ketahui.”
Artikel ini pertama kali tayang di situs www.the-scientist.com
